大约从1503年至1506年
蒙娜丽莎创作于达·芬奇人生的转折点，即从服务了17年的米兰斯佛扎宫廷，回到了佛罗伦斯。很有可能在那段时间里，达·芬奇赢得了政治家马基维利的支持，他主要从事军事工程，利用业余时间创作绘画作品。达·芬奇画完蒙娜丽莎之后，便投入到了亚诺河改造计划。
蒙娜丽莎原作的尺寸：纵77cm、横53cm，该作品画在一块黑色的杨木板上。蒙娜丽莎画像没有眉毛和睫毛，面庞看起来十分和谐。直视蒙娜丽莎的嘴巴，会觉得她没怎么笑。然而当看着她的眼睛，感觉到她脸颊的阴影时，又会觉得她在微笑。有研究人员利用微表情理论得出结论：蒙娜丽莎的微笑中，含有百分之83的高兴、百分之9的厌恶、百分之6的恐惧、百分之2的愤怒。蒙娜丽莎，坐在一把半圆形的木椅上，背后是一道栏杆，隔开了人物和背景，背景有道路、河流、桥、山峦，它们在达芬奇无界渐变着色法的笔法下，和蒙娜丽莎的微笑融为一体，散发着梦幻而神秘的气息。
文艺复兴是盛行于14世纪到17世纪的一场欧洲思想文化运动。在中世纪晚期发源于佛罗伦萨，后扩展至欧洲各国。欧洲源自对基督教统治下中世纪的批判，产生了世俗价值观念。人的观念在达·芬奇等艺术家的观念里居于核心的地位，蒙娜丽莎也展现了神性和人性的光辉，肯定了人从自然状态脱离而存在的意义。
在蒙娜丽莎创作之前，就有一幅，艾尔沃斯蒙娜丽莎。油画：艾尔沃斯蒙娜丽莎出自达芬奇，其创作时间远远早于蒙娜丽莎油画作品。艾尔沃斯蒙娜丽莎绘画，人物的面色清新红润，不沾岁月痕迹，有着与蒙娜丽莎非常相似的长相、服饰、手势和神秘笑容，只是更为年轻。有专家还曾利用碳定年法对艾尔沃斯蒙娜丽莎进行了测定，结果显示，该幅画创作于15世纪。
